Thèse Etude des Étapes Précoces de la Synthèse de la Grande Sous-Unité Ribosomique chez les Eucaryotes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies Laboratoire de recherche : MCD - Molecular, Cellular and Developmental Biology Unit Direction de la thèse : Yves HENRY ORCID 0009000383967910 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-07-15T23:59:59 Les ribosomes sont les seules machines moléculaires capables de produire les protéines. Leur synthèse est donc cruciale pour la cellule, qui y consacre une part très importante de ses ressources. Les ribosomes sont constitués de deux sous-unités, une grande (60S) et une petite (40S), composée chacune d'une ou plusieurs molécules d'ARN ribosomique (ARNr) associées à de nombreuses protéines ribosomiques (PR). L'activité catalytique des ribosomes, à savoir la synthèse de la liaison peptidique, est portée par l'ARNr. Cette activité est tributaire d'une synthèse et d'un repliement corrects des ARNr et de leur assemblage adéquat avec leur PR partenaires. Les ARNr sont produits à partir de molécules précurseurs (pré-ARNr), qui contiennent des séquences additionnelles (séquences espaceurs') absentes des ARNr matures. Les pré-ARNr vont subir des modifications post-transcriptionnelles de nucléotides et des réactions de digestions pour éliminer les séquences espaceurs, et être repliés progressivement tout en s'associant avec des PR. Ces étapes ont lieu au sein de particules précurseurs dites pré-ribosomiques'. Outre les pré-ARNr et les PR, ces particules pré-ribosomiques contiennent à un stade précoce des centaines de petites particules ribonucléoprotéiques nucléolaires (snoRNP), ainsi que des facteurs dits de maturation et d'assemblage (FA). snoRNP et FA interagissent de manière transitoire avec les particules pré-ribosomiques et sont essentiels pour leur assemblage et leur maturation.
Le sujet de thèse concerne les étapes précoces d'assemblage et de maturation des particules pré-ribosomiques précurseurs de la grande sous-unité ribosomique (particules pré-60S). Ces étapes figurent parmi les moins comprises de la synthèse des ribosomes eucaryotes. Ceci est notamment dû au fait que peu de données structurales sont disponibles pour les particules pré-ribosomiques correspondantes. En particulier, on ne dispose pas de structures atomiques complètes de ces particules, contrairement à des particules pré-60S plus tardives dont les structures ont été obtenues par microscopie électronique cryogénique (cryo-ME). On sait néanmoins que les particules pré-60S précoces contiennent des dizaines de snoRNP et de FA, essentiels à leur formation et maturation.
Le but du projet de thèse sera d'élucider chez la levure Saccharomyces cerevisiae les fonctions moléculaires précises d'une machine moléculaire présente dans les particules pré-60S précoces, constituée d'une snoRNP contenant le petit ARN snR190 associée à un complexe de cinq FA, nommé complexe Npa1, comprenant les protéines Npa1, Npa2, Nop8, Rsa3 et l'hélicase d'ARN à boîtes DEAD Dbp6. Les études seront également étendues aux rôles des homologues de ces facteurs dans des cellules humaines, où la formation de cette machine moléculaire reste à démontrer. Chez la levure, nous avons mis en évidence que cette machine moléculaire est requise pour les étapes précoces de la synthèse de la grande sous-unité. Le projet de thèse aura pour but de déterminer le rôle de cette machine dans l'assemblage des particules pré-ribosomiques par spectrométrie de masse quantitative, dans le repliement des pré-ARNr par la technique de SHAPEmap et dans la modification et la maturation des pré-ARNr par des approches haut débit et de séquençage d'ARN de type nanopore. En parallèle, nous déterminerons la structure de la machine moléculaire de levure et humaine (si nous avons au préalable pu démontrer son existence) par cryo-ME, isolée ou insérée dans des particules pré-ribosomiques. Ces structures permettront de concevoir des mutations ciblées au sein de la machine moléculaire inhibant certaines interactions clés pour en déterminer l'importance fonctionnelle en utilisant les approches listées ci-dessus. Collectivement, ces études devraient accroître significativement notre compréhension des mécanismes moléculaires en jeu dans les étapes précoces de la synthèse de la grande sous-unité ribosomique eucaryote.
Le sujet de thèse concerne les étapes précoces d'assemblage et de maturation des particules pré-ribosomiques précurseurs de la grande sous-unité ribosomique. Ces étapes figurent parmi les moins comprises de la synthèse des ribosomes eucaryotes. Ceci est notamment dû au fait que beaucoup moins de données structurales sont disponibles pour les particules pré-ribosomiques correspondantes. En effet, des structures à l'échelle atomique de particules pré-ribosomiques plus tardives ont pu être obtenues par microscopie électronique cryogénique (cryo-ME), permettant de proposer et de tester des hypothèses concernant le mode d'action de snoRNP et FA qu'elles contiennent. On ne dispose pas de structures atomiques complètes de particules pré-ribosomiques très précoces dans la voie de synthèse de la grande sous-unité. On sait néanmoins que ces particules précoces contiennent des dizaines de snoRNP et de FA, notamment des hélicase d'ARN qui pourraient remodeler des structures d'ARNr ou des interactions ARNr/protéines et des snoRNP en complexe avec des FA, en particulier la machine moléculaire snoRNP snR190/complexe Npa1. Ces facteurs jouent des rôles essentiels dans les étapes précoces de la synthèse de la grande sous-unité, rôles qui restent à élucider au plan moléculaire. Les objectifs du projet sont de mieux comprendre le déroulement et les processus mis en jeu lors des étapes précoces de la synthèse de la grande sous-unité ribosomique chez le levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules humaines en culture. Il s'agira en particulier de déterminer chez S. cerevisiae la structure et les rôles moléculaires d'une machine moléculaire présente dans les particules pré-60S précoces, constituée d'une snoRNP contenant le petit ARN snR190 associée à un complexe de cinq FA, nommé complexe Npa1, comprenant les protéines Npa1, Npa2, Nop8, Rsa3 et l'hélicase d'ARN à boîtes DEAD Dbp6. Il s'agira par ailleurs de déterminer chez les cellules humaines en culture si les homologues humains des composants de la machine moléculaire de levure s'associent également entre eux et si les rôles de cette machine moléculaire sont conservés ou différents de la levure à l'homme. 1. Assemblage des particules pré-60S précoces chez la levure:
Les rôles des différents membres de la machine moléculaire snR190 snoRNP/complexe Npa1 dans l'assemblage des particules pré-60S précoces seront évalués en purifiant par chromatographie en tandem ces particules à partir de cellules sauvages et de cellules où l'un des composants de la machine moléculaire a été inactivé. Les compositions des particules (en FA et PR) seront identifiées par spectrométrie de masse quantitative sans marquage, en collaboration avec Jade Jaubert et Stéphane Claverol, Bordeaux Protéome, Université de Bordeaux, et comparées.
2. Repliement des pré-ARNr des particules pré-60S précoces chez la levure :
Les particules pré-60S précoces seront purifiées par chromatographie d'affinité à partir de cellules sauvages ou de cellules où l'un des composants de la machine moléculaire a été inactivé. Ces particules seront traitées par l'agent acylant 1M7 qui réagit avec tous les nucléotides qui ne sont pas appariés (régions simple brin), ou le solvant seulement (DMSO). Les pré-ARNr présents dans ces particules seront purifiés via un protocole que nous avons mis au point puis soumis une étape de transcription inverse (collaboration avec Bruno Sargueil, CiTCoM, Université Paris-Cité). L'acylation de nucléotides due à l'action du 1M7 induit la transcriptase inverse à incorporer des nucléotides erronés, conduisant à des mutations au sein des produits d'amplification PCR générés à partir des ADN complémentaires obtenus. Le patron de mutations permet d'identifier les nucléotides/séquences non appariés dans les pré-ARNr de départ et d'en déduire des modèles de structures secondaires des pré-ARNr initiaux dans les conditions sauvages et mutantes.
3. Patron de modification des pré-ARNr des particules pré-60S précoces chez la levure:
Les patrons de 2'O-métylation et de pseudouridylation des pré-ARNr issus de particules pré-60S précoces purifiées à partir de cellules sauvages ou de cellules dont l'un des membres de la machine moléculaire snR190 snoRNP/complexe Npa1 a été inactivé seront déterminés par les approches haut débit RiboMethSeq' et HydraPsySeq' en collaboration avec Yuri Motorin et Virginie Marchand, IBSLor/IMoPA, CNRS-Université de Lorraine, Nancy. Nous tenterons aussi de déterminer le patron de modification des pré-ARNr purifiés par séquençage nanopore pour avoir des informations sur les molécules uniques de pré-ARNr.
4. Structure de la machine moléculaire de levure snR190 snoRNP/complexe Npa1 isolée :
Nous avons pu purifier par chromatographie d'affinité en tandem à partir de cellules de levure la machine moléculaire snR190 snoRNP/complexe Npa1 isolée. Sa structure sera déterminée par cryo-ME, en collaboration avec Célia Plisson-Chastang, MCD/CBI, qui a déjà obtenu la structure de la snoRNP snR190 en association avec Nop8 (résultats non publiés).
5. Structure de la machine moléculaire de levure snR190 snoRNP/complexe Npa1 associée aux particules pré-60S :
Nous sommes en train de mettre au point la purification par chromatographie d'affinité en tandem de particules pré-60S contenant la machine moléculaire, notamment en utilisant des cellules de levure dépourvues de l'hélicase d'ARN Dbp7 qui intervient dans la dissociation de la snoRNP snR190 des particules pré-60S. La structure des particules pré-60S contenant la machine moléculaire sera analysée par cryo-ME par Matthias Thoms de l'équipe de Roland Beckmann, Gene Center, Université de Munich, Allemagne. Les membres de cette équipe sont des spécialistes reconnus de la détermination de structures de particules pré-ribosomiques par cryo-ME. Il est probable que de nombreux domaines de ces particules seront trop flexibles pour que leur structure puisse être déterminée par cryo-EM. Néanmoins, la détermination préalable de la structure de la machine moléculaire isolée sera une grande aide pour la positionner dans l'enveloppe des particules pré-60S purifiées.
Ces structures (machine moléculaire isolée et machine moléculaire insérée au sein de particules pré-60S) permettront de concevoir des mutations ciblées au sein de la machine moléculaire inhibant certaines interactions clés pour en déterminer l'importance fonctionnelle en utilisant les approches listées ci-dessus.
6. Identification et analyse fonctionnelle de l'homologue de la machine moléculaire snR190 snoRNP/complexe Npa1 dans les cellules humaines :
Les homologues de Npa1 (URB1 chez l'homme), Npa2 (URB2 chez l'homme), Nop8 (NOL8 chez l'homme) et Dbp6 (DDX51 chez l'homme) ont été identifiés, mais il n'a pas été déterminé si ces facteurs forment un complexe. La capacité de ces facteurs à former un complexe sera déterminée en purifiant les protéines précitées sous forme étiquetée (par la technique CRIPSPR-Cas9) dans des conditions qui inhibent la synthèse de novo de particules pré-ribosomiques (ajout de drogues inhibant l'activité de l'ARN polymérase I). Les protéines co-purifiées seront visualisées par coloration Coomassie et identifiées par spectrométrie de masse. Le/les petits ARN associés seront identifiés par marquage pCp et séquençage Illumina. Les sites de fixation sur l'ARNr des facteurs d'intérêt seront identifiés par la méthode de pontage aux UV CRAC' (CRoss-linking and Analysis of cDNAs). La production des facteurs d'intérêt sera inhibée par siRNAs ou shRNAs et les effets de leur invalidation sur l'assemblage des particules pré-60S, la modification et le repliement des pré-ARNr seront analysés par les approches décrites ci-dessus pour la levure.

Maîtrise en biologie moléculaire/génétique/biologie cellulaire ou équivalent.