Thèse Détournement du Trafic Intracellulaire par Salmonella Mécanismes Moléculaires et Conséquences sur la Pathogenèse H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies Laboratoire de recherche : IPBS - Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale Direction de la thèse : Denis HUDRISIER ORCID 0000000236319561 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-31T23:59:59 Les salmonelles sont des pathogènes intracellulaires facultatifs représentant la deuxième cause de maladies diarrhéiques en Europe selon l'autorité européenne de sécurité alimentaire (EFSA). À l'instar de nombreux pathogènes humains, la survie et la réplication de Salmonella au sein des cellules de son hôte dépendent de la formation d'un compartiment spécialisé, appelé ici la « vacuole contenant Salmonella » (SCV). Le maintien de cette niche intracellulaire repose sur un contrôle fin du trafic endosomal de l'hôte, orchestré par l'injection de plusieurs dizaines de protéines bactériennes effectrices dans le cytosol. Ces dernières détournent la fonction et la localisation des protéines cellulaires, notamment en ciblant les modifications post-traductionnelles, permettant ainsi une altération rapide et réversible des voies de signalisation de l'hôte. Parmi les modifications post-traductionnelles, l'ubiquitination non-dégradative s'impose comme un déterminant majeur du contrôle du trafic intracellulaire. En particulier, les enzymes déubiquitinases (DUBs), chargées de retirer l'ubiquitine d'un substrat, peuvent contrôler le positionnement des endosomes en modifiant les fonctions et interactions des protéines responsables de l'organisation spatiale intracellulaire. Par ailleurs, près d'un tiers de l'ubiquitinome des cellules hôtes est modifié pendant l'infection, suggérant une modulation importante de ces voies par Salmonella. Néanmoins, une minorité de ces modifications sont attribuables aux fonctions connues à ce jour des protéines effectrices bactériennes, et le rôle exact de la machinerie d'ubiquitination de l'hôte dans la formation de la SCV reste largement méconnu. Ce projet vise à élucider la contribution des DUBs à l'établissement de la SCV à travers la reprogrammation du trafic intracellulaire induite par la bactérie. À partir de deux criblages préliminaires, nous avons identifié plusieurs DUBs candidates et leurs régulateurs bactériens potentiels. L'objectif est de définir une cartographie mécanistique intégrant l'action des protéines effectrices, la régulation des DUBs et les processus conduisant à la formation d'une SCV mature et permissive à la réplication bactérienne. Enfin le potentiel thérapeutique d'inhibiteurs pharmacologiques de DUBs sera examiné dans des modèles physiologiques d'infection. Dans le contexte actuel d'émergence mondiale de souches multirésistantes aux antibiotiques, ces travaux ouvriront la voie au développement de stratégies anti-infectieuses alternatives ciblant des mécanismes infectieux reposant sur des protéines de l'hôte. Salmonella est une bactérie pathogène intracellulaire facultative capable de créer d'une niche réplicative spécifique au sein des cellules infectées, la vacuole contenant Salmonella (SCV). Pour assurer la maturation de ce compartiment et éviter sa dégradation lysosomale, la bactérie doit remodeler de manière fine le trafic intracellulaire de la cellule hôte. Ce détournement passe par l'injection, via des systèmes de sécrétion de type 3 (T3SS), d'une quarantaine de protéines effectrices ciblant les mécanismes cellulaires de l'hôte. Notamment, la manipulation des modifications post traductionnelles des protéines hôtes constitue un levier rapide et efficace pour reprogrammer les voies de signalisation de la cellule infectée. Parmi les mécanismes cellulaires impactés, l'ubiquitination des protéines hôtes subit des remaniements majeurs lors de l'infection. Des analyses protéomiques ont révélé que plus de 27 % de l'ubiquitinome des cellules épithéliales infectées est modifié, bien qu'une minorité seulement de ces altérations soit directement liée à une activité directe d'ubiquitination ou de dé-ubiquitination des protéines effectrices bactériennes. Ce constat suggère une manipulation de la machinerie d'ubiquitination hôte. L'ajout d'une ubiquitine à un substrat (aka, ubiquitination) est assuré par une cascade enzymatique E1-E2-E3. Ce processus est réversible grâce aux déubiquitinases (DUBs), des enzymes capables de cliver les ubiquitines. Par ailleurs, l'ubiquitination non dégradative est apparue comme un régulateur central du positionnement et de l'interactions des compartiments endosomaux. En contexte infectieux, nous avons déjà montré l'implication pro-bactérienne d'une DUB cellulaire, USP32, qui coordonne le recyclage membranaire à la surface de la SCV précoce et en promeut la maturation. La caractérisation des interactions moléculaires entre la bactérie et les DUBs est fondamentale pour mieux comprendre la régulation du trafic intracellulaire par Salmonella. De plus, plusieurs inhibiteurs spécifiques de DUBs sont aujourd'hui sur le marché ou en cours de développement, faisant de cette classe d'enzymes une cible privilégiée pour l'étude de thérapies hôte dirigées. Ces traitements visent des mécanismes cellulaires impliqués dans la formation d'une niche protectrice intracellulaire plutôt que la bactérie elle-même et permettront de complémenter les traitements conventionnels antibactériens, en tant qu'alternative ou par utilisation en combinaison. Dans un contexte marqué par l'émergence de souches multirésistantes, ces travaux s'intègrent au développement de stratégies thérapeutiques innovantes. Ils visent à améliorer l'efficacité des antibiothérapies conventionnelles ou proposer des alternatives de recours face aux impasses cliniques les plus sévères. Objectif 1 : caractériser le rôle des DUBs dans la maturation de la vacuole contenant Salmonella.
Objectif 2 : élucider le contrôle des DUBs par les protéines effectrices bactériennes.
Objectif 3 : définir le mécanisme reliant l'activité des DUBs avec la maturation de la niche vacuolaire bactérienne
Ce projet de doctorat s'inscrit dans la continuité de criblages complémentaires réalisés lors de stages précédents. Lors d'un premier criblage par petit ARN interférant (siRNA), nous avons identifié des DUBs impactant significativement l'infection des cellules épithéliales par Salmonella. De plus, à travers un deuxième criblage basé sur l'utilisation d'une sonde d'activité déubiquitinase couplée à de la spectrométrie de masse quantitative, nous avons identifié grâce les protéines effectrices régulant l'activité de DUBs spécifiques. Les premiers mois de la thèse seront consacrés à la validation de ces criblages, en utilisant des sondes d'activité enzymatique et des analyses par Western Blot pour confirmer la modulation d'activité des DUBs, tout en consolidant les résultats de siRNA par microscopie en cellule vivante. La suite de ce projet s'articule autour de trois axes majeurs mêlant imagerie de pointe, génétique cellulaire et bactérienne et protéomique quantitative. L'Objectif 1 vise à caractériser le rôle des DUBs dans la maturation de la vacuole contenant Salmonella. Pour cela, des lignées cellulaires épithéliales déplétées en ces enzymes par siRNA seront infectées par des souches fluorescentes rapportrices de la maturation de la SCV. L'utilisation innovante de micro-motifs de matrice extracellulaire permettra de standardiser la géométrie cellulaire pour quantifier précisément le positionnement et les différents marqueurs de maturation de la SCV. Par ailleurs, l'utilisation de modèles d'organoïdes intestinaux et d'inhibiteurs spécifiques permettra de confirmer la pertinence physiologique de ces DUBs lors de l'infection, tout en évaluant leur potentiel en tant que cibles pour des thérapies hôte-dirigées. L'Objectif 2 cherche à élucider le contrôle des DUBs par les protéines effectrices bactériennes en comparant l'infection de souches sauvages et de mutants délétés de protéines effectrices spécifiques. La dynamique de recrutement des DUB et la maturation de la SCV seront suivies en temps réel pour reconstruire le modèle de régulation de cette signalisation. La pertinence physiologique des couples effecteurs-DUB sera encore une fois évaluée dans des modèles d'infections sur organoïdes. Enfin, l'Objectif 3 s'attache à déchiffrer les voies de signalisation en identifiant les substrats cellulaires dont l'ubiquitination est détournée. Cette étape repose sur une analyse de l'ubiquitinome par spectrométrie de masse (méthode diGly), suivie d'une validation fonctionnelle par une stratégie de remplacement génique, où la protéine endogène est substituée par un variant non-ubiquitinable pour confirmer son impact sur le processus infectieux. Le détail et la planification des différentes étapes de la démarche expérimentale sont fournis dans le projet annexe. L'ensemble de ces approches comparatives aboutira à une cartographie mécanistique intégrée, reliant les effecteurs de Salmonella, la modulation des DUBs de l'hôte, les voies de signalisation impliquées et les conséquences sur le processus infectieux.

L'étudiant doit être titulaire d'un Master ou équivalent en biologie avec des connaissances approfondies en interactions hôte-pathogène. Il est essentiel que le candidat figure parmi les meilleurs de sa promotion en Master. Nous recherchons un candidat passionné par l'infectiologie, capable de travailler en équipe et de faire preuve d'autonomie. La capacité à communiquer efficacement lors de présentations scientifiques orales et écrites est essentielle. Une expertise théorique et technique en expérimentation biologie cellulaire et moléculaire est souhaitée.