Thèse Compréhension et Contrôle de la Physiologie du Champignon Filamenteux Rhizopus Oryzae Exploration Intégrée du Métabolisme et de la Morphologie de la Cellule au Milieu de Culture H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering Direction de la thèse : César Arturo ACEVES-LARA ORCID 0000000162913655 Début de la thèse : 2026-06-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 La biodiversité, la flexibilité et la robustesse métabolique des champignons filamenteux en font des usines « cellulaires » efficaces pour la production de métabolites d'intérêt, tels que les acides organiques, protéines, enzymes et antibiotiques... [1]. Ces microorganismes jouent également un rôle majeur dans la bioéconomie circulaire grâce à leur capacité à assimiler différents types de substrats [2]. En culture submergée, les champignons peuvent se développer sous diverses morphologies : (i) la forme filamenteuse où les hyphes sont librement dispersés dans le milieu, et (ii) la forme « pellets », où le mycélium développe des agrégats sphériques, constituées d'hyphes fortement enchevêtrées. D'autres formes intermédiaires telles que la croissance floconneuse ou granulaire ont également été identifiées [3]. Le type morphologique et la physiologie associée dépendent fortement des caractéristiques intrinsèques de chaque espèce et des conditions de culture, notamment la composition du milieu de culture, la concentration en inoculum, le pH, la température et le stress mécanique [4, 5]. Chaque morphologie a une influence distincte sur la rhéologie du milieu de culture, les phénomènes de transport et la productivité associée [6, 7]. Par exemple, les formes agrégées entrainent généralement une faible viscosité, tandis que les hyphes (mycélium) libres entrainement une baisse de la productivité spécifique des microorganismes en raison d'un mauvais transfert de l'oxygène et des nutriments [15]. La compréhension et le contrôle de ces morphologies sont donc essentielles pour mettre en oeuvre et/ou optimiser une production à l'échelle industrielle.

Différentes techniques ont été développées pour caractériser la morphologie des microorganismes filamenteux [8, 9]. La microscopie optique (analyse en 2D) permet d'analyser et caractériser les formes mycéliennes librement dispersées et les petits agrégats en raison de leur géométrie relativement simple. Cependant, les morphologies les plus complexes, comme les pellets, nécessitent des techniques tridimensionnelles plus sophistiqués telles que la tomographie (structures internes des champignons), encore peu explorées. Des approches de modélisation existent pour prédire la morphologie et décrire les interactions complexes avec l'environnement, mais elles restent en grande partie théoriques et peu généralisables, en partie à cause du manque de données sur les structures tridimensionnelles [11-15].

Ce doctorat vise à relever le défi du contrôle et de la compréhension de la physiologie (métabolisme et morphologie) des champignons filamenteux au cours de cultures, en utilisant Rhizopus Oryzae comme modèle d'étude. L'objectif est d'identifier les paramètres/conditions environnementales influençant la physiologie de ce champignon, et de développer des méthodes de caractérisation pertinentes et extrapolables. La stratégie expérimentale combinera des instruments et équipements de pointe, tels que la morpho-granulométrie, la pince optique couplée à la microfluidique, le rhéoscope, la tomographie, et des systèmes de culture à géométrie sur mesure, avec des observations réalisées à l'échelle de la cellule unique et à l'échelle du milieu de culture. Filamentous microorganisms, both eukaryotic and prokaryotic, are widely used in industrial processes to produce organic acids, antibiotics, and other valuable compounds in the pharmaceutical and food industries [16]. Filamentous microorganisms are particularly important, generating several billion dollars in annual sales with their products [16]. The production of citric acid by the filamentous (eukaryotic) fungus Aspergillus niger was established in 1919, even without an understanding of basic molecular principles and is the oldest industrial process exploiting filamentous microorganisms [17, 18]. Since then, fungal expression and production system have been developed for the production of pharmaceutical compounds, proteins and enzymes [19, 20].
Bioprocess performances depend on the metabolic potential of the microorganism (physiological responses, growth rate and productivity) under controlled cultivation conditions. With filamentous microorganisms, mass transfer limitations are strongly influenced by the rheological properties of the culture broth, which in turn depend on biomass concentration, filamentous morphology, volumetric power input, and hydromechanical stresses. Accurate quantification of biomass, morphology, and broth rheology is therefore essential for process optimization, scale-up, bioreactor design, numerical simulation, and downstream processing.
In many industrial applications with filamentous microorganisms, cell morphology represents a bottleneck for productivity. Process optimization requires characterization of inter-dependencies between process parameters and performance. Therefore, it has always been a goal to characterize and model cellular morphology [21]. For the quantification of mycelial morphology, early studies relied on manual measurements of hyphal growth and branching as well as the development of the cube-root law for pellets [22]. Modern techniques include automated image analysis, fractal dimension analysis, lacunarity, laser light diffraction (LLD), confocal laser scanning microscopy (CLSM), and flow cytometry, in particular, allows rapid and robust characterization of fungal particle size distributions in bioprocess environments [23]. Integrating morphological and rheological data allow the development of holistic models linking filamentous morphology, viscosity, and productivity. For example, in A. niger, highly productive mycelial morphologies are associated with increased culture viscosity, highlighting the potential to estimate productivity from rheological measurements [24, 25].
Regarding R. oryzae, current knowledge includes literature on its metabolism, identification of standard culture media for solid-state and submerged fermentation, and elemental composition of the strain in different forms (spores, vegetative cells). However, gaps remain in understanding the relationship between morphology and productivity, the effects of environmental and mechanical culture conditions on morphogenesis, the specific rheological properties of its culture media, and the development of robust methods for multi-scale morphological characterization. Addressing these gaps is crucial to integrate single-cell and culture-level observations for modelling population dynamics and optimizing bioprocess performance. Objectifs:
This PhD thesis aims to understand and monitor the physiology of filamentous fungi during cultivation, using R. oryzae as a model organism. The objective is to identify the environmental parameters and culture conditions that influence the morphology and metabolism of this fungus, and to develop relevant methods to characterize its morphological evolution, ultimately leading to generalizable models for rational bioprocess scale-up.
The experimental strategy will rely on state-of-the-artcutting-edge instruments and equipments (morphogranulometer, optical tweezers, rheoscope, tomography, and customised culture system geometries). A multi-scale approach will be implemented, combining observations at both the single cell level and the culture medium level, associated with modelling approaches integrating metabolism, rheometry, morphology and population balance).

Key research objectives:
- How fungal metabolism can be modulated by defining and understanding critical culture conditions (nutritional requirements or limitations, physico-chemical environments and mechanical constraints)?
- What are the key environmental parameters and culture conditions that influence the morphogenesis of the fungus and its metabolism?
- Can we propose and develop relevant and generalisable methods for characterising fungal morphology across different scales?
- How single cell observations can be integrated with culture-level data to model physiological evolution and population dynamics?

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Objectifs:
Cette thèse vise à comprendre et à suivre la physiologie des champignons filamenteux en culture, en utilisant R. oryzae comme organisme modèle. L'objectif est d'identifier les paramètres environnementaux et les conditions de culture qui influencent la morphologie et le métabolisme de ce champignon, ainsi que de développer des méthodes adaptées pour caractériser son évolution morphologique, afin d'aboutir à des modèles généralisables en vue d'une mise à l'échelle rationnelle des bioprocédés.
La stratégie expérimentale s'appuiera sur des instruments et équipements de pointe (morphogranulomètre, pince optique, rhéoscope, tomographie, ainsi que des systèmes de culture à géometries sur mesure). Une approche multi-échelle sera mise en oeuvre, combinant des observations à la fois à l'échelle de la cellule unique et à celle du milieu de culture, associées à des approches de modélisation intégrant le métabolisme, la rhéométrie, la morphologie et les bilans de population.

Principaux objectives :
- Comment le métabolisme fongique peut-il être modulé en définissant et en comprenant les conditions critiques de culture (besoins ou limitations nutritionnels, environnements physico-chimiques et contraintes mécaniques) ?
- Quels sont les paramètres environnementaux et les conditions de culture clés qui influencent la morphogenèse du champignon et son métabolisme ?
- Peut-on proposer et développer des méthodes pertinentes et généralisables pour caractériser la morphologie fongique à différentes échelles ?
- Comment intégrer les observations à l'échelle de la cellule unique avec les données à l'échelle de la culture pour modéliser l'évolution physiologique et la dynamique de population ?
Méthode :
Task, milestones and experimental strategy linked to scientific challenges:

WP1 - Single cell observation: morphologic evolution during germination
Task 1.1: Germination kinetics in solid state fermentation (SSF)
Objective: Monitor spore-to-vegetative cell germination and morphological deviations in SSF
Approach: automated microscopic observation with online image analysis (Morphologi G3S, TBI - equipment FR FERMaAT)
Knowledge Contribution: Population-level analysis using morpho-granulometric parameters; identification of discriminating criteria for different morphological forms (filamentous, diffuse pellets, dense pellets...).

Task 1.2: Germination kinetics in submerged culture
Objective: Study germination and morphological changes in liquid culture.
Approach: immobilized cell culture in microfluidic channels, coupled with optical tweezers (equipment TBI - EAD7) and microscopic observations, ability to precisely modulate physico-chemical environment.
Knowledge contribution: Same as Task 1.1, correlation between single-cell morphology and environmental conditions.

WP2 -Cell broth: morphological evolution and control in submerged culture
Task 2.1: Observation of growth under controlled shear-rates
Objective: investigate morphological evolution, critical shear stress (mechanical lysis), and cell orientation.
Approach: Rheoscope (rheometer coupled with inverted microscope, RheoScope Mars3 @IMFT, FR FERMAT).

Task 2.2: Growth kinetics and morphological deviations under mechanical stress in shaken flasks
Objective: Evaluate the impact of shear stress and turbulence.
Approach: Use flat and baffled flasks with specific designs, characterize cell-free and pellet populations (morpho-granulometry, tomography), broth rheology, substrate, biomass, and metabolite quantification (chromatographic techniques).
Parallel Action (collaboration @TBI): CFD modeling of flow patterns vs flask design, operating conditions, and rheology extraction of critical factors (shear rate, free surface effects, projections...).
Knowledge Contribution:
Bioactivity: Kinetics of growth and production.
Biophysics: Linking morpho-granulometry and rheology with population balance, operating conditions, and critical mechanical factors.

WP3 - Exploration of metabolic deviation in relation with morphology
Task 3.1: Quantification of metabolic activity
Measure at single-cell and population levels using viability assays, metabolite production, and flux analysis (cytometry and specific marker).
Task 3.2: Linking metabolic states to morphological forms and environmental conditions
Establish correlations between metabolites states, morphological forms, and environmental conditions in SSF and submerged cultures.
Task 3.3: Integration and predive modeling
Combine metabolic, morphological and rheological data to develop predictive models of growth, metabolite production, and morphological evolution.
Knowledge contribution:
Establishment of quantitative links between metabolism, morphology, and process parameters.
Development of predictive, multi-scale models for bioprocess optimization and scale-up.

Formation : diplôme d'ingénieur ou master avec une spécialité en microbiologie, génie biologique ou biotechnologies obtenus en France ou en Europe (AgroParisTech, Institut Agro, INSA, Polytech, ENSAIA, ONIRIS, TU Braunschweig-GER, RWTH-GER, Denmark TU-DN, WUG-NTL, BOKU-AU, UAB-SP...).

Compétences techniques :
- Maîtrise théorique et pratique en Génie Microbiologique/Fermentation (travail en condition stérile),
- Préparation de milieux de culture, conduite de cultures en fiole et en bioréacteur selon différentes stratégies de culture, traitement des données),
- Connaissances en chimie analytique,
- Bonne capacité rédaction et de synthèse.

Aptitudes recherchées
- Force de proposition, capacité d'apprentissage et d'adaptation, autonomie,
- Rigueur, conscience professionnelle, sens de l'organisation, curiosité, dynamisme.