Thèse Analyse des Chemins Évolutifs Conduisant à l'Émergence de Virus Influenza Aviaires Hautement Pathogènes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National Polytechnique de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : IHAP - Laboratoire Interactions Hôtes-Agents Pathogènes Direction de la thèse : Romain VOLMER ORCID 0000000315913251 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 Les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) sont issus de virus influenza aviaires faiblement pathogènes (VIAFP) qui ont évolué génétiquement par l'acquisition d'acides aminés basiques au niveau du site de clivage de l'hémagglutinine (HA), rendant cette HA très efficacement clivable par des protéases de type furine. Cette évolution est observée naturellement uniquement pour des virus possédant une HA de sous-type H5 ou H7. L'objectif de ce projet est de déterminer quelle est l'influence de la séquence nucléotidique de l'HA des VIAFP sur le risque d'évolution vers un VIAHP.
Notre hypothèse est que l'émergence de VIAHP résulte d'un processus évolutif graduel, au cours duquel l'HA subit des mutations lui permettant d'acquérir des acides aminés la rendant progressivement de plus en plus clivable par les protéases de type furine. La restriction de l'émergence de VIAHP à certaines souches de virus H5 et H7 pourrait s'expliquer par leur capacité à gagner un avantage sélectif suffisant à chaque étape de ce chemin évolutif. Nous souhaitons ainsi comprendre les chemins évolutifs compatibles avec l'émergence de VIAHP et identifier les virus pour lesquels cette évolution est très peu probable.
Afin de répondre à ces questions, nous mènerons des analyses combinant prédictions bio-informatiques, essais fonctionnels reposant sur des pseudovirus exprimant diverses HA et vérifications fonctionnelles dans des virus influenza modifiés génétiquement. Enfin, ces données seront intégrées dans des modèles mathématiques afin de quantifier l'avantage sélectif des différents variants et prédire leur risque d'émergence. Si ces méthodes sont validées, elles devraient permettre de classer les HA en fonction de leur risque d'évolution vers une forme hautement clivable par les protéases de type furine et ainsi contribuer à une gestion prédictive des émergences de VIAHP.
Les virus de l'influenza aviaire A peuvent être classés en virus influenza aviaires faiblement pathogènes (VIAFP) ou en virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) selon leur pathogénicité chez les volailles1. Le principal déterminant de la pathogénicité du virus chez les oiseaux est la clivabilité de la glycoprotéine de surface hémagglutinine (HA). La HA des VIAFP possède un seul acide aminé basique qui est clivé par des protéases de type trypsine présentes dans les voies respiratoires et le tractus intestinal des oiseaux. En revanche, la HA des VIAHP comporte un site de clivage multibasique (MBCS) qui peut être traité protéolytiquement par des protéases de type furine, présentes dans toutes les cellules de l'organisme, permettant ainsi au virus de se propager de manière systémique et de provoquer une maladie grave2-5.
Par conséquent, les VIAHP constituent une menace majeure pour les volailles et les oiseaux sauvages6,7. Le passage de VIAFP à VIAHP est également associé à un risque zoonotique accru, comme cela a été observé avec les virus H5N16,8. L'acquisition naturelle d'un MBCS dans la HA n'a été décrite que pour des virus appartenant aux sous-types H5 et H71. Cependant, le risque qu'un LPAIV de type H5 ou H7 évolue en HPAIV reste actuellement inconnu. L'identification des mécanismes contribuant à l'émergence des HPAIV pourrait, à terme, permettre d'améliorer les méthodes de surveillance afin d'identifier et de contrôler les LPAIV susceptibles d'évoluer vers des HPAIV, au bénéfice de la santé animale et de la santé publique.
Au niveau mécanistique, l'acquisition d'un MBCS dans la HA se produit soit via des erreurs de la polymérase ARN-dépendante ARN (RdRp) virale entraînant des substitutions et/ou des insertions de nucléotides, soit par recombinaison non homologue¹.

Des travaux précédents du laboratoire ont montré que la séquence nucléotidique avait une influence majeure et direct sur le risque d'insertion de nucléotides, pouvant conduire à l'émergence de VIAHP. Les méthodes développées et résultats obtenus ont ouvert la voie au projet présenté ici qui a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la restriction à certains virus H5 et H7 de l'évolution vers les VIAHP par insertion et substitution (les recombinaisons étant déjà étudiées par ailleurs au laboratoire).
Le projet répond à quatre objectifs scientifiques principaux :
1) Décrire de façon exhaustive les différentes combinaisons d'acides aminés pouvant constituer le site de clivage de l'HA des virus influenza A et déterminer le niveau de clivabilité de ces HA en utilisant les outils de prédiction disponibles
2) Évaluer la capacité de certaines HA sélectionnées à permettre l'entrée de pseudovirus dans les cellules
3) Vérifier et comparaison de la capacité réplicative de virus influenza portant certaines HA
4) Intégrer ces données dans un modèle mathématique permettant de mieux comprendre l'influence de différents niveaux de clivabilité HA sur la probabilité d'émergence
L'objectif est de former un.e doctorant.e à la virologie moléculaire en le rendant capable de maitriser des outils d'analyses bio-informatiques et de collaborer avec des mathématiciens. Ainsi formé.e, il/elle pourra développer dans le futur des approches scientifiques transdisciplinaires.
1) Décrire de façon exhaustive les différentes combinaisons d'acides aminés pouvant constituer le site de clivage de l'HA des virus influenza A et déterminer le niveau de clivabilité de ces HA en utilisant les outils de prédiction disponibles.
La première étape consiste en la création d'une base de données regroupant toutes les séquences uniques correspondant à une fenêtre de 20 nucléotides centrée sur le site de clivage de l'HA des virus influenza. Nous simulerons toutes les mutations pouvant introduire des acides aminés basiques dans ces séquences et calculerons pour chacune des séquences sauvages et mutées le score de clivabilité par les protéases de type furine en utilisant les algorithmes de prédiction ProP9 et PiToul10.

2) Évaluer la capacité de certaines HA sélectionnées à permettre l'entrée de pseudovirus dans les cellules
Les pseudovirus sont des systèmes expérimentaux reposant sur des virus incapables de réplication en dehors de cellules trans-complémentantes et pouvant insérer à leur surface des glycoprotéines virales. Leur entrée, quantifiable grâce à un gène rapporteur, dépend de la fonctionnalité de la glycoprotéine exogène exprimée. Ils présentent donc deux avantages majeurs : ils sont très sûrs d'utilisation et facilement manipulables, permettant de tester un grand nombre de glycoprotéines dans des conditions de sécurité optimale en laboratoire BSL2. Au laboratoire, nous utilisons des pseudovirus issus de lentivirus défectifs exprimant le gène rapporteur luciférase. Dans ce système, nous testerons la fonctionnalité d'environ vingt HA différentes sélectionnées à partir des résultats de prédiction par les algorithmes ProP et PiToul. Nous pourrons ainsi mesurer simultanément l'impact des mutations introduites sur la maturation de HA par clivage protéolytique (indispensable à l'entrée) et déterminer leur impact sur la capacité de liaison aux récepteurs exprimés par les lignées cellulaires MDCK et DF1 et de changement de conformation pH-dépendante.

3) Vérifier et comparaison de la capacité réplicative de virus influenza portant certaines HA
Afin de tester la fonctionnalité et l'avantage sélectif conférés par certaines mutations, les HA présentant les caractéristiques les plus intéressantes seront étudiées dans un contexte plus naturel. Pour cela, nous utiliserons la technique de génétique inverse et introduirons ces HA dans le génome de virus influenza. Afin de réduire les risques biologiques liés à ces manipulations, nous utiliserons une souche virale atténuée par mutations de gènes internes, selon un protocole validé par le Comité d'expertise des utilisations confinées d'OGM (CEUCO) pour une manipulation des virus en laboratoire BSL3, disponible au sein de notre unité de recherche.
Nous analyserons la capacité réplicative de ces virus influenza dans différents systèmes épithéliaux ex vivo (oeufs embryonnés, et « tracheal organ cultures ») issus de poulets et canards qui représentent des hôtes naturels de ces virus. Ainsi, nous déterminerons l'impact des mutations introduites sur la capacité réplicative des virus et déterminerons les niveaux relatifs d'avantages sélectifs en réalisant des co-infections et mises en compétition de variants viraux. Les virus présentant les phénotypes les plus intéressants dans les modèles ex vivo seront testés au cours d'infections expérimentales sur poulet ou canard afin de déterminer les conséquences de certaines mutations HA sur le pouvoir pathogène et le tropisme tissulaire viral. Ces expérimentations pourront être réalisées dans l'animalerie de niveau BSL3 disponible dans l'unité de recherche après accord du comité d'éthique à l'expérimentation animale.

4) Intégrer ces données dans un modèle mathématique permettant de mieux comprendre l'influence de différents niveaux de clivabilité HA sur la probabilité d'émergence
Grâce à une collaboration avec Sebastian Lequime (Groningen University, Pays-Bas), les données de croissance virale et d'avantages sélectifs relatifs seront intégrés dans un modèle mathématique permettant d'évaluer les probabilités qu'un variant devienne majoritaire, en fonction de son avantage sélectif, de la proportion relative des variants et des données sur le tropisme viral collectées lors des expérimentations in vivo.

Étudiant.e titulaire d'un master 2, possédant un fort intérêt pour l'évolution virale, possédant de solides compétences en biologie moléculaire et une très bonne capacité d'intégrer des données provenant de champs disciplinaires différents.