Thèse la Trypacidine un Nouveau Contaminant Toxique de la Filière Viticole H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National Polytechnique de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : TOXALIM - Laboratoire de Toxicologie Alimentaire Direction de la thèse : Olivier PUEL ORCID 0000000319465310 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 La trypacidine est une mycotoxine produite par Aspergillus fumigatus, un champignon filamenteux colonisant les voies respiratoires humaines. La toxicité de la trypacidine, qui n'a été évaluée que sur l'épithélium alvéolaire pulmonaire et bronchique, est connue pour induire une nécrose cellulaire dans les 24 heures. Jusqu'à récemment, on considérait que seul A. fumigatus pouvait produire de la trypacidine, celle-ci étant par conséquent considérée comme un problème de qualité de l'air. Cependant, en 2008, une nouvelle espèce d'Aspergillus, A. uvarum, a été isolée de baies de raisin provenant du bassin méditerranéen. Des travaux non publiés, menés par l'équipe d'accueil, a démontré la présence du cluster de gènes de la voie de biosynthèse de la trypacidine dans le génome d'A. uvarum. De plus, la production de trypacidine a aussi été observée en laboratoire sur différents types de milieux (milieux synthétiques, baies de raisin inoculées, etc.). Ainsi, la présence potentielle d'A. uvarum sur le raisin fait de la trypacidine un nouveau contaminant alimentaire pouvant menacer la sécurité des consommateurs. L'objectif de ce projet est d'évaluer les risques potentiels liés à la consommation de produits dérivés du raisin (jus de fruits et vins) susceptibles de contenir de la trypacidine. Aussi, le projet de thèse se concentrera (I) sur le développement d'une méthode de dosage de trypacidine dans les raisins, les mouts, les produits à base de raisins (jus et vins) suivie d'analyse sur les différents produits achetés dans le commerce, (II) l'évaluation de la stabilité et la persistance de la trypacidine tout au long des différents processus de vinification (III) la caractérisation du danger grâce à une évaluation détaillée du profil toxicologique de la trypacidine. La filière viticole occupe une place centrale dans le secteur agricole français. En 2024, la France a produit 37 millions d'hectolitres de vin, ce qui en fait le deuxième producteur mondial après l'Italie. Le secteur s'étend sur 750 000 hectares et représente 11 % de la superficie mondiale des vignobles. Cependant, comme de nombreuses autres cultures, la vigne est sensible aux infections fongiques. Certaines espèces fongiques produisent des mycotoxines, des métabolites secondaires toxiques qui peuvent contaminer les aliments (notamment les céréales, le café, les raisins, les fruits et les fruits secs) et les rendre impropres à la consommation humaine ou animale. Parmi ces mycotoxines, l'ochratoxine A (OTA) est actuellement la seule réglementée pour les produits dérivés du raisin, avec une teneur maximale autorisée de 2 ppb dans le jus de raisin et le vin (règlement UE 2023/915).
Ce projet se concentre sur la trypacidine, une mycotoxine non réglementée connue pour être produite par Aspergillus fumigatus, un champignon filamenteux pathogène pour les voies respiratoires humaines. La taille des spores de ce dernier (environ 3 microns) leur permet de circuler facilement dans les voies respiratoires jusqu'aux alvéoles pulmonaires. Bien que les spores puissent être éliminées par le système immunitaire des personnes saines, ce champignon provoque des pathologies sévères comme des formes invasives d'aspergillose chez les patients immunodéprimés [1]. Néanmoins, plusieurs cas d'aspergillose pulmonaire aiguë ont été rapportés chez des patients immunocompétents [2,3,4], comme des rhinites professionnelles chez des personnes travaillant dans des lieux humides [5]. L'équipe d'accueil a précédemment démontré que la trypacidine était présente sur les spores d'A. fumigatus et présentait une toxicité envers les cellules pulmonaires humaines [6] et les cellules épithéliales intestinales (Fig. 1, données non publiées). Jusqu'à récemment, on pensait que la production de trypacidine était l'apanage d'A. fumigatus (section Fumigati), ce qui en faisait principalement un problème lié à la qualité de l'air.
Cependant, de nouvelles découvertes non publiées de l'équipe d'accueil révèlent que tous les isolats disponibles d'Aspergillus uvarum, une espèce isolée à partir de raisin [7], sont capables de produire de la trypacidine dans divers milieux, y compris des milieux synthétiques, des milieux à base de jus de raisin et des baies de raisin inoculées (non publié). L'équipe d'accueil a également mis en évidence la présence du cluster de gènes biosynthétiques responsable de la biosynthèse de la trypacidine dans le génome d'A. uvarum (Fig. 2) identifié chez A. fumigatus il y a quelques années [8, 9]. Ces résultats soulignent le risque que la trypacidine pénètre dans la chaîne alimentaire par le biais de produits dérivés du raisin, ce qui met en évidence l'importance de poursuivre les recherches afin d'élucider tout risque sanitaire associé. La barrière intestinale étant la première ligne de défense contre des xénobiotiques, nous étudierons l'effet de la trypacidine sur des cellules intestinales humaines. Nous déterminerons si la trypacidine peut induire un effet cytotoxique et/ou génotoxique sur des cellules en culture et peut donc ainsi présenter un danger pour la santé humaine. Méthode

Développement d'une méthode de dosage de la trypacidin dans les moûts, les jus de fruit et les vins.La qualification sera réalisée en LC-MS en Electrospray Ionization positive en utilisant les transitions suivante m /z 345 -> 313 et m/z 345 -> 301. Contrairement à nos travaux antérieurs (2010-2012), la trypacidin est commercialement disponible, ce qui nous permet non seulement la détection mais également le développement d'une méthode de quantification. Une gamme étalon ainsi que des contrôles qualités (QC) seront réalisés dans les matrices (Jus de raisin, moût et vin)
L'utilisation du standard interne marquée est envisagée. En effet, le gold standard des standards internes est la même molécule que la molécule à doser, mais marquée avec un isotope stable. Le standard ayant la même structure chimique, il aura le même comportement physico-chimique lors de la séparation chromatographique, donc le même temps de rétention. Les deux molécules (standard interne et molécule à doser) se différencieront seulement par leur masse. A défaut d'une molécule marquée, nous utiliserons comme un standard interne la géodine avec une structure similaire mais qui se différentie uniquement par l'intégration d'atome de chlore et l'absence d'un groupement methoxy.
La méthode de quantification sera validée conformément aux directives de la Food and Drug Administration (FDA) en termes de sélectivité, de linéarité, de répétabilité et de reproductibilité.
La sélectivité sera testée en comparant six chromatogrammes de matrice à blanc avec des chromatogrammes aux limites de quantification (LOQ). La limite de détection (LOD) sera définie comme la concentration estimée avec un signal égal à trois fois le bruit moyen de six matrices à blanc au temps de rétention de l'analyte. Les courbes d'étalonnage seront évaluées sur des modèles linéaires (Y = aX + b) et quadratiques (Y = aX² + bX + c) avec les pondérations suivantes : 1, 1/X et 1/X² (X = concentration nominale). La linéarité de la courbe d'étalonnage sera évaluée à l'aide de trois approches : (1) le calcul de l'écart-type relatif entre la concentration nominale et la concentration obtenue avec le modèle (RSD %), qui devrait être inférieur à ±15 % (sauf à la limite de quantification, ±20 %), (2) l'inspection visuelle de la distribution des résidus, qui doit être randomisée autour de la moyenne et, (3) un test d'adéquation pour vérifier la qualité de l'ajustement du modèle

Le devenir de la trypacidine en fonction des procédés de vinification appliqués aux moûts de raisin contaminés

Certaines mycotoxines, comme la patuline, sont dégradées par certaines levures. C'est le cas de Saccharomyces cerevisiae, qui transforme cette mycotoxine en ascladiol au cours de la fermentation alcoolique, une étape de la fabrication du cidre ou des boissons alcoolisées à base de pomme. Est-ce le même cas pour la trypacidine. Pour y répondre des microvinifications seront réalisées.
Microvinifications en presence de trypacidin
Dans un premier temps, un essai préliminaire sera mené à l'aide de trypacidine naturelle afin d'étudier le comportement de la molécule au cours de la fermentation alcoolique et malolactique. Des échantillons seront prélevés à différentes étapes de la fermentation et la trypacidine sera quantifiée afin de déterminer une éventuelle dégradation. Des essais sur deux moûts de raisins différents, issus de cépages blancs et rouges, seront menés dans deux volumes différents (5 et 10 L) en trois répétitions.
Dans un deuxième temps, et au cas où une dégradation de la trypacidine serait observée lors de l'essai préliminaire, des essais de microvinification seront menés en laboratoire avec des moûts de raisin contaminés par de la trypacidine marquée au 13C. La fermentation alcoolique sera réalisée avec trois souches de levure différentes, en trois répétitions. Deux microvinifications incluant une fermentation malolactique seront également testées en trois répétitions. Des échantillons seront prélevés avant, pendant et après la fermentation. Les teneurs en trypacidine seront mesurées et de nouveaux métabolites identifiables par la présence d'un profil isotopique seront recherchés par HPLC-MS/MS.

Evaluation de la toxicité

Dans un premier temps, afin d'évaluer sa pertinence toxicologique, la cytotoxicité de la trypacidine envers la lignée cellulaire colorectale humaine HCT116 sera comparée et classée par rapport à celle des autres métabolites majeurs par A. uvarum. L'identification du métabolome sera réalisé par HPLC et spectrométrie de masse à partir d'extraits de culture d'A. uvarum cultivé sur un milieu synthétique à base de jus de raisin.
La cytotoxicité de ces différents composés sera évaluée à l'aide du test de viabilité CellTiter-Glo après une exposition de 24 et 48 heures

Mécanisme de cytotoxicité

Des travaux antérieurs de l'équipe [1] ont démontré que la trypacidine induit un effet cytotoxique sur des cellules pulmonaires humaines¹. Dans ce modèle cellulaire, la trypacidine provoque une production intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), telles que l'oxyde nitrique (NO) et le peroxyde d'hydrogène (HO), dès les premières heures d'exposition. Ce stress oxydant entraîne une mort cellulaire nécrotique dans les 24 heures. S'appuyant sur ces résultats, notre étude s'attachera tout d'abord à déterminer si la trypacidine induit un stress oxydatif dans les cellules épithéliales intestinales et à caractériser les modes de mort cellulaire qui s'ensuivent, notamment la nécrose et ou d'autres mécanismes comme l'apoptose ou la pyroptose (forme inflammatoire de mort cellulaire).
La production intracellulaire d'ERO sera quantifiée par cytométrie en flux à l'aide de sondes fluorescentes spécifiques pour le peroxyde d'hydrogène (HO), l'anion superoxyde (O) et l'oxyde nitrique (NO). En outre, l'expression des gènes impliqués dans la réponse anti-oxydante (SOD, CAT, HO1, NQO1, GPX,....) sera également étudiée par RT-qPCR. La nécrose sera évaluée en mesurant la libération de lactate déshydrogénase (LDH) dans le milieu de culture. L'apoptose sera caractérisée par la fragmentation/condensation des noyaux (microscopie) ainsi que par la translocation des phosphatidylserines membranaires (par cytométrie en flux) qui sont typiques de l'apoptose. Le processus apoptotique sera précisé en mesurant l'activité enzymatique des caspases effectrices 3/7 (microscopie), ainsi que l'apparition des formes clivées de la caspase 3, de la caspase 8 (caspase initiatrice de la voie extrinsèque de l'apoptose), des facteurs de régulation de la voie mitochondriale de l'apoptose Bax, Bak, Noxa, PUMA, Bcl-2 et Mcl-1 par Western-Blot. De même, l'activation de la caspase-1 et la sécrétion d'Il1- signes de pyroptose, seront recherchées.
Le stress oxydatif pouvant résulter d'un dysfonctionnement mitochondrial, nous étudierons plus en détail l'impact de la trypacidine sur la respiration cellulaire et la phosphorylation oxydative. La bioénergétique cellulaire sera analysée à l'aide du Seahorse XF Analyzer, permettant la mesure en temps réel du taux de consommation d'oxygène (OCR) et du taux d'acidification extracellulaire (ECAR). Cette approche intégrée nous permettra d'élucider les mécanismes moléculaires et métaboliques sous-jacents à la cytotoxicité induite par la trypacidine dans les cellules intestinales.

Potentiel génotoxique de la trypacidine

La structure chimique de la trypacidine présente des similitudes notables avec celle de la griséofulvine, un composé antifongique (fig. 3). Il a été rapporté que la griséofulvine présentait des propriétés génotoxiques, notamment l'induction de micronoyaux dans des lignées cellulaires de rongeurs et dans des lymphocytes humains in vitro [10,11]. Dans des études expérimentales, elle a également induit des adénomes et des carcinomes hépatocellulaires chez la souris, ainsi que des adénomes et des carcinomes des cellules folliculaires thyroïdiennes chez le rat. Ces résultats ont contribué à son classement comme substance potentiellement cancérigène pour l'homme (groupe 2B) par le Centre international de recherche sur le cancer. Compte tenu de ces similitudes structurelles, la trypacidine pourrait donc également présenter un potentiel génotoxique, ce qui souligne la nécessité d'étudier ses effets génotoxiques.

Le potentiel génotoxique de la trypacidine sera évalué en utilisant des plages de concentration qui n'induisent pas de cytotoxicité.
La génotoxicité sera déterminée en mesurant la capacité à induire des cassures au niveau de l'ADN selon deux approches : le test des comètes et la détection des foci H2AX et 53BP1. Le test des comètes sera réalisé en absence et en présence de formamidopyrimidine DNA-glycosylase (FPG), enzyme qui permet de révéler des cassures dues à l'oxydation des bases de l'ADN. Ce résultat sera à mettre en relation avec le stress oxydant généré par les mycotoxines. La phosphorylation de l'histone H2AX (H2AX) constitue une des réponses cellulaires aux cassures d'ADN. La protéine 53BP1 (p53-binding-protein1) est recrutée spécifiquement au niveau des sites des cassures double-brin sur l'histone H4K20 dimethylée. Nous détecterons ces protéines par méthode immunofluorescente pour quantifier la formation des foci nucléaires représentatifs des dommages à l'ADN. Nous pourrons ainsi distinguer les cassures double-brin des cassures simple brin. Si la trypacidine présente des effets génotoxiques, sa capacité à favoriser l'instabilité génomique sera étudiée en évaluant la formation de micronoyaux.

Analyse transcriptomique des voies métaboliques altérées par la trypacidine

Afin d'identifier les voies moléculaires perturbées par l'activité biologique de la trypacidine, les analyses de toxicité seront complétées par un profilage transcriptomique à l'aide de puces à ADN. Des cellules HCT116 seront traitées pendant 24 heures avec des concentrations de trypacidine faiblement et modérément cytotoxiques afin de mettre en évidence les programmes transcriptionnels associés au stress cytotoxique. L'ARN total sera extrait et soumis à un profilage transcriptomique par séquençage d'ARN. Une analyse de l'expression génique différentielle et un enrichissement des voies (analyses GO, KEGG et basées sur des réseaux (Ingenuity, String db)) seront effectués afin d'identifier les gènes, les voies de signalisation et les réseaux de régulation significativement modulés. Cette approche permettra d'identifier les gènes différentiellement exprimés et les voies biologiques affectées, fournissant ainsi des informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'exposition à la trypacidine.

Effet de la trypacidine sur la barrière intestinale

Nous évaluerons si la trypacidine est capable de traverser la barrière intestinale à l'aide d'un système de co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX, pertinent sur le plan physiologique. En effet, les cellules Caco-2 sont dérivées du côlon humain, mais ont la propriété d'imiter un épithélium intestinal lorsqu'elles sont cultivées sur des inserts, formant ainsi une monocouche d'entérocytes polarisés. De plus, la co-culture de cellules Caco-2 avec des cellules coliques productrices de mucus HT29-MTX fournit une couche de mucus et améliore la pertinence physiologique du modèle. La monocouche cellulaire sera exposée pendant 24 heures à la trypacidine du côté apical. Afin d'évaluer son absorption et son transport transépithélial, la trypacidine sera dosée par HPLC-DAD et/ou HPLC-MS du côté basal et dans le lysat cellulaire.
L'intégrité de la structure épithéliale sera évaluée en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l'aide de l'analyseur CellZscope en temps réel. De plus, la perméabilité paracellulaire sera quantifiée en évaluant le passage FITC-dextran de la face apicale vers la face basolatérale. De plus, l'impact sur l'intégrité structurelle du modèle épithéliale sera évalué par imagerie des protéines des jonctions serrées et du cytosquelette cellulaire.
Si la trypacidine est capable d'atteindre le compartiment basolatéral, elle peut ensuite se disséminer vers d'autres organes via la circulation systémique. Par conséquent, ses effets génotoxiques et cytotoxiques seront étudiés dans les cellules hépatiques, cellules qui jouent un rôle central dans la détoxification des xénobiotiques. Dans cette optique, des cellules humaines HepaRG seront exposées à des concentrations croissantes de trypacidine, et la cytotoxicité, le stress oxydatif et la génotoxicité seront évalués selon les même procédures que celles utilisées pour les cellules intestinales.

Nous recherchons un(e) étudiant(e) titulaire d'un master 2 ou équivalent (Ingénieur) curieux, ayant un bon sens critique, motivé, dynamique et capable de travailler en équipe. Le ou la candidat(e) devra avoir une formation en biochimie, biologie moléculaire, toxicologie et une expérience en culture cellulaire sera appréciée. Des connaissances et une première expérience en chimie analytique seraient un plus. Un niveau d'anglais B2 est requis. Une bonne maitrise des outils de bureautique, de statistiques et de bio-informatique sera appréciée mais non rédhibitoire.