Thèse Reprogrammation du Génome Bactérien pour la Réallocation des Ribosomes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering Direction de la thèse : Laurence GIRBAL ORCID 0000000287734829 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 Les bactéries ont des ressources finies qu'elles doivent répartir entre toutes les fonctions biologiques à exprimer. Les ribosomes sont une ressource couteuse. Ils assurent la traduction de tous les gènes, même ceux qui codent pour des fonctions non essentielles à la croissance dans une condition donnée. Cette thèse explore la possibilité de libérer des ribosomes de la traduction de ces fonctions non essentielles. Nous évaluerons les répercussions physiologiques de cette libération de ribosomes surnuméraires, et les réallouer à l'expression d'autres fonctions, en particulier l'expression de protéines d'intérêt. Dans l'équipe, nous avons déjà identifié 153 gènes non essentiels séquestrant ~15% des ribosomes d'E. coli. En parallèle, nous avons optimisé une méthode d'édition de bases (CRISPR-BE) couplée à un multiplexage des cibles qui permet d'abolir la traduction de gènes cibles. Le but de la thèse sera grâce à cette nouvelle méthode d'édition des génomes d'abolir la traduction de gènes non essentiels et ainsi libérer les ribosomes séquestrés. Une analyse physiologique de la souche reprogrammée au niveau de son pouvoir de traduction (polysome profiling), mais aussi de l'expression des gènes (transcriptome et stabilité des ARN) montrera si les ribosomes peuvent être surnuméraires et ré-allouables à des fonctions biologiques d'intérêt. Cette analyse permettra aussi d'identifier de potentiels mécanismes de contrôle de l'expression des gènes lorsque leur traduction est fortement modifiée. Les bactéries disposent de ressources limitées pour accomplir l'intégralité des fonctions biologiques à un instant donné. Que ces fonctions soient essentielles ou accessoires, elles doivent être assurées par une répartition optimisée des ressources disponibles.
Tout comme les ressources énergétiques, les ressources protéiques sont mobilisées pour la réalisation de grandes fonctions centrales telles que réplication, transcription et traduction. Les ribosomes, des complexes riboprotéiques qui assurent la traduction, sont une ressource fondamentale de la cellule. Composés de 3 ARN ribosomiques et de 55 protéines différentes, les ribosomes sont couteux à produire et la cellule a donc développé des systèmes de contrôle pour ajuster au mieux leur nombre à ses besoins traductionnels. Ainsi en fonction de la vitesse de croissance, leur nombre peut varier de ~7k à ~70k par cellule (1). Quel que soit leur nombre, les ribosomes doivent être répartis entre tous les ARNm présents à un instant donné dans la cellule pour assurer leur traduction.
Quand en biologie synthétique, une production supplémentaire d'une protéine d'intérêt (hétérologue, homologue ou une voie synthétique) est demandée à la cellule, la ressource « Ribosomes » qui sera engagée dans cette traduction le sera au détriment des autres fonctions biologiques. Il en résulte classiquement un ralentissement du taux de croissance (2).
L'introduction d'un codon stop dans la séquence codante d'un transcrit provoque une diminution du nombre de ribosomes portés par le messager (3). Le projet de thèse va étendre l'approche à un plus grand nombre de gènes.
Le but de la thèse sera donc de contrôler l'allocation des ribosomes entre fonctions d'intérêt et bon fonctionnement cellulaire.
L'objectif premier de la thèse est de générer une (des) souche(s) d'E. coli chez laquelle la traduction de gènes codant pour des fonctions non essentielles aura été abolie. Les ribosomes ainsi libérés constitueraient une nouvelle ressource ré-allouable à d'autres fonctions d'intérêt.
Cette reprogrammation multiple dans le génome sera réalisée en introduisant un codon stop au début de la séquence codante des gènes cibles par une méthode utilisant une variante du système CRISPR (CRISPR-BE, Base Editor) que nous avons optimisée dans l'équipe. Nous utiliserons une approche de multiplexage pour recoder simultanément plusieurs gènes à chaque cycle d'édition.

Nous analyserons la physiologie de la souche reprogrammée pour répondre à diverses questions :
- Est-ce que des ribosomes sont effectivement libérés et rendus surnuméraires dans la souche reprogrammée par rapport à la souche initiale ?
Si oui, est-ce que ces ribosomes surnuméraires sont réalloués aux fonctions biologiques restantes (croissance, surexpression de voies métaboliques) ?
Si non, quels sont les mécanismes de rétrocontrôle qui permettent d'ajuster le nombre de ribosomes à la demande traductionnelle ?
- Est-ce que les ribosomes libérés peuvent être réalloués à la production de protéines d'intérêt et quels sont les impacts sur la croissance de la souche ?
Adresser ces différentes questions contribuera à une meilleure connaissance de la traduction et de sa régulation et permettra sur le long terme une meilleure maitrise de la physiologie bactérienne et de l'utilisation des bactéries en biotechnologie.
Ce projet de thèse nécessitant l'inactivation de nombreux gènes dans un même génome, nous privilégierons une approche utilisant le système CRISPR-BE avec un développement de multiplexage des cibles. Le système CRISPR-BE fait intervenir une fusion entre la protéine dCas9 et une cytosine déaminase (CDA) (4). A l'aide d'un ARN guide, la dCas9-CDE est dirigée vers sa cible et assure la transition d'un C en T. Ainsi, une base C engagée dans un codon CAG, CAA ou CGA peut être éditée pour générer un codon stop TAG, TAA ou TGA, respectivement. Cette méthode est présentée comme ayant une très bonne efficacité d'édition et capable de cibler plusieurs copies d'un même gène sur le génome (5, 6). Nous avons développé une approche de ciblage simultané de blocs de 10 gènes par expression de modules de crRNA.

Multiplexage des crRNA et reprogrammation.
Pour chaque gène à inactiver, un crRNA sera designé en tenant compte des contraintes pour permettre à la dCas9-CBE de transformer un C et T pour inactiver l'expression du gène, ils seront combinés par blocs de 10 et synthétisés.
Leur introduction chez E. coli en association avec la dCAs9-CDA permettra l'édition des 10 gènes simultanément. La présence des mutations sera confirmée par séquençage, puis un second bloc de 10 crRNA sera introduit, et ainsi de suite pour inactiver le set de gènes de façon itérative. Les modifications de traduction seront mesurées par polysome profiling couplé à de la RT-qPCR.

Analyse des répercussions physiologiques.
La physiologie de la souche reprogrammée sera caractérisée par la détermination de la vitesse de croissance, des flux métaboliques, de la consommation de sources de carbone et de la synthèse des produits. Le nombre de ribosomes par cellule (approximé par le rapport [ARN ribosomiques]/[protéines totales]), la proportion de ribosomes engagés en traduction et leur densité sur les ARNm (polysome profiling) seront comparés entre la souche reprogrammée et la souche initiale. Les répercussions sur la dynamique de tous les ARN (édités et les autres) seront analysées par la mesure des transcriptomes et des stabilome.
L'effet sur la réallocation des ressources en ribosomes sera testé sur l'expression d'une protéine hétérologue (protéine fluorescente ou protéine d'intérêt pour l'équipe), induites à des niveaux d'expression suffisamment forts pour impacter la croissance de la souche initiale. La quantité de protéine produite, l'impact sur le taux de croissance et le niveau de productivité ([protéine fluo]/[protéines totales]) entre les deux souches seront comparés.

Domaine d'expertise requis : biologie moléculaire, microbiologie, physiologie bactérienne. Des compétences en métabolisme et analyse de données à grande échelle seront appréciées.