Thèse Rôle de Lptm dans le Transport du Lps Afin d'Identifier de Nouvelles Vulnérabilités Bactériennes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse
École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies
Laboratoire de recherche : LMGM - Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires
Direction de la thèse : Raffaele IEVA ORCID 0000000234050650
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-30T23:59:59

La membrane externe (ME) qui enveloppe les bactéries Gram-négatives constitue une plateforme d'interaction cruciale avec l'environnement environnant. Le lipopolysaccharide (LPS) s'assemble spécifiquement dans la couche externe de la ME, assurant une stabilité mécanique, formant une barrière de perméabilité à de nombreux antibiotiques et protégeant contre les défenses de l'hôte. Le LPS est synthétisé au niveau de la membrane interne (MI) et transporté à travers le périplasme par le mécanisme Lpt (transport du LPS). Ce mécanisme est composé des protéines LptA-G qui forment un pont trans-enveloppe continu (Moffatt 2025). L'étape finale de l'insertion du LPS dans la couche externe est médiée par le translocon LPS de la MO, LptDE, constitué de la protéine -barrel de la MO LptD et de sa lipoprotéine homologue LptE.
Des avancées biochimiques et structurales récentes menées par l'équipe hôte et d'autres chercheurs ont redéfini cette étape finale. Deux lipoprotéines non caractérisées auparavant, LptM (7 kDa, anciennement YifL) et LptY (14 kDa, anciennement YedD), ont été identifiées comme de nouveaux composants du translocon LPS de la membrane externe (Yang 2023 ; Chen 2025), révélant un holo-complexe LptDEMY plus vaste. LptY, qui est spécifique aux Enterobacteriaceae, contribue à stabiliser la connexion entre le translocon de la membrane externe et les composants de la membrane interne du mécanisme Lpt. LptM, qui est largement conservée chez les Enterobacteriaceae et d'autres protéobactéries, est positionnée au niveau de la porte latérale de LptD, où elle améliore la dynamique et l'assemblage du LPS.En raison de sa position centrale à l'interface entre la lumière du -baril de LptD et sa porte latérale, LptM favorise la maturation oxydative et l'activation fonctionnelle du translocon de la membrane externe, établissant ainsi un lien entre le repliement du -baril et la capacité de transport du LPS (Yang 2023 ; Chen 2025). Il est intéressant de noter qu'une autre étude (Luo 2025) et des données non publiées de l'équipe hôte montrent qu'une sous-population de LptM est libérée par le translocon et se retrouve exposée à la surface cellulaire, mais les conséquences régulatrices de ce mécanisme sont inconnues.
Dans l'ensemble, ces études mettent en évidence un niveau de régulation du transport du LPS jusqu'alors méconnu, car LptM favorise la maturation du translocon et intervient au niveau du changement de conformation au sein du complexe LptDEMY. Les résultats de l'équipe hôte indiquent que LptM est orienté vers le périplasme et lié à LptD, mais qu'une sous-population est libérée du translocon et devient exposée à la surface. Ainsi, LptDEMY et LptDEY coexistent dans la membrane externe, mais leurs activités différentielles n'ont pas encore été explorées.
Le rôle régulateur précis des mécanismes médiés par LptM est au coeur de cette proposition de projet de doctorat.

The outer membrane (OM) encasing Gram-negative bacteria represents a crucial interaction platform with the surrounding environment. Lipopolysaccharide (LPS) assembles specifically in the OM external leaflet, providing mechanical stability, forming a permeability barrier to many antibiotics, and protecting from host defenses. LPS is synthesized at the inner membrane (IM) and transported across the periplasm by the Lpt (LPS transport) machinery. This machinery is composed of LptA-G that forms a continuous transenvelope bridge (Moffatt 2025). The terminal step of LPS insertion into the external leaflet is mediated by the OM LPS translocon LptDE, made of the OM -barrel protein LptD and its cognate lipoprotein LptE.
Recent biochemical and structural advances by the host team and others have redefined this final step. Two previously uncharacterized lipoproteins, LptM (7 kDa, formerly YifL) and LptY (14 kDa, formerly YedD), have been identified as novel components of the OM LPS translocon (Yang 2023; Chen 2025), uncovering a larger LptDEMY holo-complex. LptY which is restricted to Enterobactericeae, contributes to stabilize the connection between the OM translocon and the IM components of the Lpt machinery. LptM, which is broadly conserved in Enterobacteriaceae and in other proteobacteria, is positioned at the lateral gate of LptD, where it enhances dynamics and LPS assembly. Owing to its central positioning at the interface between the LptD -barrel lumen and its lateral gate, LptM promotes oxidative maturation and functional activation of the OM translocon, linking -barrel folding with LPS transport competence (Yang 2023; Chen 2025). Intriguingly, another study (Luo 2025) and unpublished data by the host team show that a subpopulation of LptM is released by the translocon, becoming exposed to the cell surface, but the regulatory consequences of this mechanism are unknown.
Taken together these studies highlight a previously unrecognized level of LPS transport regulation, as LptM promotes translocon maturation and acts at the conformational switch within the LptDEMY complex. The results of the host team indicate that LptM faces the periplasm bound to LptD, however a subpopulation is released from the translocon, becoming surface exposed. Thus, LptDEMY and LptDEY co-exist in the OM, but their differential activities are unexplored.
The precise regulatory role the LptM-mediated mechanisms is in the focus of this PhD project proposal.

Aim 1 - Determine the relative abundance of LptDEMY and LptDEY
We will use native mass spectrometry (collaborator J. Marcoux, IPBS) to determine the relative amounts of LptDEMY vs LptDEY complexes. We will investigate LptM exposure to the cell surface using cysteine engineering in LptM and maleimide PEGylation, which will increase the protein mass when reacting with surface-exposed protein segments. Alternative tests include in vivo immunolabeling of surface-exposed LptM with fluorophores (Luo 2025). Using site-specific photocrosslinking (Chen 2025), we will investigate whether LptM reaches the cell surface moving along the LPS transport path in LptD. The results will enable us to evaluate the mechanism of LptM-surface exposure, and how stress conditions (surfactants and antibiotics) or growth rates (fast exponential vs slow stationary phase) influence LptDEMY-to-LptDEY conversion.
Aim 2 - Evaluate LPS assembly by LptDEMY and LptDEY
Two approaches will be used: in vitro, reconstituting IM and OM Lpt components in separate proteoliposomes and monitoring LPS transfer (Sherman 2018); in vivo, using wild-type and lptM cells and metabolic labelling of LPS with clickable azido-sugars that will enable fluorescent labelling of newly assembled LPS at the cell surface. The distribution of newly assembled LPS will be correlated to that of LptDEMY and LptDEY (Aim1), enabling us to infer on their respective LPS transport activities.
Aim 3 - Evaluate the impact of LptM in promoting fitness under envelope stress
The host team has identified a LptD variant with an enhanced rate of LptM release to cell surface. OM permeability assays, antibiotic susceptibility testing, and envelope stress reporter analysis will correlate the LptDEMY/LptDEY ratio with defects in membrane homeostasis and bacterial fitness. This test will also be conducted in E. coli expressing rough (short sugar-chain) or smooth (containing O-antigen, long sugar chain) LPS, to challenge LptDEMY and LptDEY activities with LPS of different sizes. The role of LptM in antibiotic resistance will be tested also in pathogenic strains of Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas and Neissieria.
Aim 4 - Design LptM mimicking peptides as LPS translocon inhibitors
An established collaboration between the host team and Bicycle Tx (Cambridge, UK) has led to the identification of bicyclic peptides (Allyjuan 2025) that bind the LptD lateral gate similar to LptM (unpublished data). In collaboration with B. van den Berg (Newcastle, UK), the applicant will determine the cryoEM structures of LptD in complex with the compounds, revealing the inhibitory interfaces. Using a deep learning-based approach trained on the comparison of the LptD-M interfaces in different proteobacteria, our collaborators will modify the bicycle compound to develop inhibitors specific for LptD of other species.

biologie moleculaire